Méthodes d’étude de la cellule ( Biologie cellulaire )

Les trois niveaux d'étude de la cellule

La cellule s'étudie à trois niveaux complémentaires, chacun avec ses outils :

• L'étude morphologique, qui repose sur la microscopie (observation de la forme et de la structure).
• L'étude biochimique, qui fait appel aux techniques de biochimie (électrophorèse, chromatographie, ELISA), développées dans le module de biochimie.
• L'étude physiologique (étude du fonctionnement), qui s'appuie sur la culture cellulaire.

Ce chapitre développe trois grands axes : la microscopie, la préparation des biopsies pour le microscope optique, et la culture cellulaire.

La microscopie

Six microscopes sont utilisés en médecine. Ils se distinguent par leur source d'éclairage, leurs constituants optiques et leur usage clinique.

1. Le microscope optique (MO)

Il est utilisé en médecine pour analyser les biopsies des patients afin de compléter un diagnostic, et pour observer la structure de la cellule (membrane – cytoplasme – noyau). Il est constitué d'une lampe photonique et de trois lentilles en verre : le condenseur, l'objectif (x4, x10, x100) et l'oculaire (x10). Ses autres pièces mécaniques sont le socle, la potence et la platine.

2. Le microscope à fluorescence (MF)

Identique au MO, sauf sa source d'éclairage : une lampe à UV qui détecte les colorants fluorescents. Il est utilisé en immunofluorescence pour le marquage cellulaire.

3. Le microscope confocal (MC)

C'est un microscope à fluorescence amélioré, qui détecte la fluorescence avec plus de précision. Ses trois améliorations sont : un éclairage par laser ; un pinhole qui ne récupère que le signal utile ; un photomultiplicateur qui numérise le signal et reconstitue l'image avec une localisation précise de la fluorescence. Application médicale : exploration de tumeurs abdominales (ex. tumeur d'origine ovarienne).

4. Le microscope inverse (MI)

Destiné à l'observation de cellules vivantes, non colorées, en culture. Ses objectifs spéciaux transforment les différences d'amplitude en différences de phase.

5. Le microscope électronique à transmission (MET)

Permet d'observer l'ultrastructure de la cellule (les organites). Ses différences avec le MO : éclairage par faisceau électronique ; condenseur, objectif et oculaire sous forme de bandes magnétiques ; pompe à vide empêchant la déviation des électrons ; images toujours en noir et blanc. Application médicale : diagnostic du syndrome de Guillain-Barré (axone démyélinisé entouré de macrophages).

6. Le microscope électronique à balayage (MEB)

Constitué de quatre éléments : le faisceau électronique, le détecteur d'électrons, le convertisseur des électrons en image et le moniteur (écran). Il permet l'observation des reliefs cellulaires (cellules en 3D).

Ne pas confondre les deux microscopes électroniques : le MET observe l'ultrastructure (organites) en transmission, en noir et blanc ; le MEB observe les reliefs de surface en 3D. Attention aussi : le confocal utilise un laser (pas une lampe UV comme le MF).

Préparation des biopsies pour le microscope optique

Technique cytologique (le frottis)

Elle concerne les cellules libres, en suspension : sang, moelle osseuse, frottis vaginal, frottis buccal, liquide d'ascite, liquide céphalo-rachidien. Elle comporte quatre étapes : prélèvement des cellules → dépôt sur lame → étalement → coloration. La coloration utilise le MGG (May-Grünwald Giemsa) : le May-Grünwald colore le cytoplasme en rose, le Giemsa colore le noyau en bleu.

Technique histologique

Elle concerne les tissus consistants (foie, peau, muscle, os, rein, poumon…) et comporte cinq étapes, chacune avec un rôle précis.

Les colorants standards sont l'éosine (colorant acide, cytoplasme en rose) et l'hématéine (colorant basique, noyau en bleu). Les deux colorations standards pour le diagnostic sont l'HE (hématéine-éosine) et l'HES (hématéine-éosine-safran, le safran colorant les fibres en jaune, utile pour détecter les fibroses). Les coupes sont montées entre lame et lamelle.

Chaque étape a un rôle unique à ne pas confondre : la fixation (Bouin) maintient l'état proche du vivant ; l'inclusion (paraffine) remplace l'eau intracellulaire et durcit le tissu pour la coupe ; la coloration introduit le contraste. La paraffine n'est donc PAS un fixateur.

Code couleur des colorations standards : noyau bleu (hématéine), cytoplasme rose (éosine), fibres jaune (safran, uniquement dans l'HES).

La culture cellulaire (étude du fonctionnement)

Applications médicales (×3)

• Réalisation du caryotype : détection des anomalies génétiques.
• Étude des effets des molécules thérapeutiques avant l'AMM (Autorisation de Mise sur le Marché), en trois phases : phase 1 (essais in vitro sur cellules en culture), phase 2 (essais chez l'animal), phase 3 (essais cliniques chez l'humain).
• PMA (Procréation Médicalement Assistée) : culture in vitro, de l'œuf à l'embryon implanté chez la mère.

Conditions de culture (×5)

• Température de +37 °C (étuve).
• pH de 7 à 7,4 (étuve avec 5 % de CO₂).
• Stérilité maximale : hotte à flux laminaire, lampes à UV germicides.
• Récipients en plastique à usage unique : flacons, boîtes de Petri, tubes à essai.
• Milieux de culture liquides (ex. MEM, RPMI 1640), composés d'eau, sels minéraux, vitamines, acides aminés ou protéines, glucose, antibiotiques, sérum de veau fœtal (SVF) et facteurs de croissance.

Étapes de la technique (×9)

Prélèvement d'un fragment tissulaire vivant → dissociation mécanique (scalpel ou ciseaux) → trypsination (la trypsine dissocie les cellules) → addition d'un milieu de culture (10 ml) → numération cellulaire (comptage) → repiquage si le nombre dépasse 10⁶ cellules/10 ml, avec ajustage du milieu → étuvage à 37 °C → observation et comptage quotidiens des cellules au microscope inverse.

La culture cellulaire est la technique d'entretien et de multiplication in vitro de cellules vivantes, dans des conditions contrôlées de température, de pH et de stérilité, à des fins diagnostiques (caryotype), pharmacologiques (AMM) ou de procréation (PMA).

La culture exige des cellules VIVANTES : aucune fixation (qui les tuerait). La dissociation se fait par la trypsine, et la surveillance quotidienne au microscope inverse.