Outils biologie moléculaire partie1

Introduction Les techniques de biologie moléculaire reposent sur des principes fondamentaux issus du métabolisme cellulaire (réplication, correction des erreurs, hybridation, enzymes de restriction) et de la physique des acides nucléiques (dénaturation, renaturation). Leur connaissance a un grand intérêt pour le diagnostic des pathologies génétiques, tumorales et infectieuses. Extraction des acides nucléiques Nature du spécimen En diagnostic, le spécimen le plus utilisé est le sang. Autres : culture, urines, organes, biopsies. En médecine légale : salive, cheveux, sperme. ADN « fossile » : tissus mous (momies) ou durs (os, dents). Les spécimens doivent être recueillis stérilement. Le sang doit être collecté sur tube EDTA (anticoagulant chélateur de calcium). Étapes de l'extraction d'ADN génomique (à partir de sang) Lyse des globules rouges Centrifugation → culot de globules blancs Lyse des globules blancs (solution SLB) Dégradation des protéines (protéinase K) Extraction proprement dite (phénol-chloroforme ou hautes concentrations de sels → précipitation des protéines) Précipitation de l'ADN (éthanol absolu froid) Le sang doit être recueilli sur tube EDTA (pas héparine pour la biologie moléculaire). L'ADN est précipité par l'éthanol absolu froid. Les outils enzymatiques Les enzymes de restriction (endonucléases) Les enzymes de restriction sont des endonucléases qui reconnaissent des séquences spécifiques de l'ADN double brin (sites de restriction, généralement palindromiques de 4 à 8 pb) et coupent les 2 brins à des endroits précis. La coupure peut être à bouts francs (coupure au même niveau sur les 2 brins) ou à bouts cohésifs (coupure décalée → extrémités simple brin complémentaires). Les bouts cohésifs facilitent…