Outils biologie moléculaire partie 2

La PCR (Polymerase Chain Reaction) Principe La PCR est une technique d'amplification in vitro (décrite en 1985 par K. Mullis) permettant d'amplifier spécifiquement de façon exponentielle des séquences d'ADN cible. Elle utilise une ADN polymérase thermorésistante (jusqu'à 100°C) isolée d'une archéobactérie thermophile (Taq polymérase). Elle nécessite un couple d'amorces oligonucléotidiques de 15 à 25 nucléotides (primers) encadrant le fragment à amplifier. Après 30 cycles, on obtient environ 10⁶ copies de la séquence amplifiée. L'amplification est exponentielle : au bout de n cycles → théoriquement 2ⁿ exemplaires. Les 3 étapes d'un cycle de PCR ÉtapeTempératureMécanisme 1. Dénaturation95°CSéparation des 2 brins d'ADN 2. HybridationSpécifique du couple d'amorces (Tm)Fixation des amorces sur les brins cibles. Tm = 4(G+C) + 2(A+T) 3. Extension (élongation)72°CIncorporation des 4 dNTP par la Taq polymérase dans le sens 5'→3' Les 2 amorces doivent avoir des Tm voisins pour faciliter le choix de la température d'hybridation. Formule Tm amorce = 4(G+C) + 2(A+T). Le séquençage de l'ADN Le séquençage est la détermination de l'ordre des nucléotides dans une séquence d'ADN. Méthode de Sanger (séquençage par terminaison de chaîne) : utilisation de didésoxyribonucléotides (ddNTP) marqués par des fluorochromes différents. Les ddNTP n'ont pas de groupement 3'OH → ils arrêtent la polymérisation quand ils sont incorporés. Séparation des fragments par électrophorèse capillaire et lecture par un laser. Applications médicales de la biologie moléculaire DomaineApplications Diagnostic des maladies génétiquesDétection de mutations, diagnostic prénatal, diagnostic pré-implantatoire Diagnostic des maladies infectieusesPCR pour détecter virus (HIV, HCV, HBV), bactéries, parasites OncologieDétection de mutations somatiques (thérapies…